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巨细胞病毒感染

标签: 巨细胞病毒感染

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诊断编辑本段回目录

巨细胞病毒感染巨细胞病毒感染
单靠临床表现不能诊断CMV感染,从临床标本中分离出病毒,同时抗体呈出4倍以上增加或持续抗体滴度升高,将有助于诊断。

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一、病毒分离
最好用唾液、尿液、生殖道分泌物、乳汁白细胞,接种到人的成纤维细胞内繁殖和分离,细胞病变效应在1天或数周后出现,经固定和HE染色后可观察到巨细胞,核内有内包涵体,核周晕圈及嗜酸性胞浆内包涵体,很象“猫头鹰眼”(owl′s eye)亦可用单克隆或多克隆抗体的荧光染色等方法检查。
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二、血清抗体检测
最常用的有补体结合试验、间接免疫荧光试验、免疫酶试验、间接血凝试验和放射免疫试验等检测CMV-IgG和IgM抗体。当单份血清标本已确定既往有CMV感染时,应当立即留血清标本,以及间隔2周、4周、8周再留血清标本,结合病毒分离可作原发感染诊断。 医学百科网-MedBaike. com

三、DNA探针
已广泛应用于检测CMV,其中以32P标记的探针敏感性最高,对某些标本来说,杂交方法可能比病毒分离更敏感。 医学百科网-MedBaike. com

四、聚合酶链式反应
(一)标本的采集及处理
采集的标本包括患者的血液、尿,以及腺体组织等。由全血制备的血沉棕黄层(buffy coats)可保存于-80℃;尿液标本可保存于液氮中。冻存标本应避免反复冻融。 医学百科网-MedBaike. com

尿液标本经2500r/min离心10min,以除去细胞碎片,收集上清液。由于尿液中含有PCR抑制剂,因此需用聚乙二醇(PEG6000)进行预处理:50μl尿上清与50μl 20%PEG6000和25μl 2mol/L NaCl混合,置冰浴中6h;15000r/min离心30min收集沉淀。再于6400r/min离心3min;尽可能吸去上清,将沉淀悬浮于蒸馏水中。该悬液可直接用于PCR扩增;扩增时应于100℃加热10min,迅速置冰浴中冷却。 医学百科网-MedBaike. com

巨细胞病毒感染巨细胞病毒感染
(二)模板DNA的制备
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1、由血液标本制备模板DNA
方法A:向血清中加入NaCl使最终浓度为150mmol/L;取10μl 此血清于70℃处理45s后即可直接进行PCR扩增。 医学百科网-MedBaike. com

方法B:由血沉棕黄层(BCP)制备:
① 用PBS洗涤BCP两次,收取沉淀。
② 加入500μl 6mol/L盐酸胍,匀浆。

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③ 加入30μl 10mmol/L EDTA,10mmol/L NaCl,30μl20% Sarcosyl和5μl 蛋白酶K(10mg/ml),混合均匀,60℃反应1h。
④ 加入1130μl 的乙醇,-20℃沉淀1~2h。 医学百科网-MedBaike. com
⑤ 离心收集DNA沉淀。⑥ 用70%乙醇洗两次,最后将沉淀悬浮于少量10mmol/L Tris-HCl,1mmol/L EDTA中。置4℃备用。 医学百科网-MedBaike. com

2、由冰冻组织标本制备模板DNA:
① 用恒冷切片机切取一块5~10μm冰冻组织块,置于1.5ml塑料管中。 医学百科网-MedBaike. com
② 加入10%用缓冲液配制的福马林。
③ 10min后离心1~2min轻轻倾去上清液,沉淀用乙醇洗2次。
④ 于室温干燥10~60min。⑤ 加入抽提缓冲液(100mmol/L Tris-HCl,4mmol/L EDTA、pH8.0,400μg/ml蛋白酶K),使刚好浸没沉淀物(约50~100μl );将沉淀捣碎。福马林固定的或石蜡包埋组织经脱蜡和干燥后也可按此处理。
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⑥ 37℃放置过液。
⑦ 置沸水中7min灭活蛋白酶K。
⑧ 离心收集上清,取1~10μl 即可进行PCR扩增。

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3、由尿液标本制备模板DNA:
①100μl 尿上清液与100μl 6mol/L异硫氰酸胍,7μl 2mol/L NaCl和20μl 玻璃粉悬液(DNA PREP,Asahi Glass Co,Tokyo)混合。
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② 室温放置10min后,6400r/min离心2min,收集沉淀。
③ 沉淀用50%乙醇,10mmo/L Tris-HCl、pH7.4, 50mmol/L NaCl洗一次,6400r/min离心1min。
④ 同样洗涤沉淀2次,收集沉淀。
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⑤ 加入50μl 蒸馏水,于55℃作用15min。
⑥ 15000r/min离心2min,收集上清(含HCMV DNA),进行PCR扩增,将此悬液于100℃加热10min,并迅速于冰浴中冷却。

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巨细胞病毒感染巨细胞病毒感染
(三)引物及探针 医学百科网-MedBaike. com
引物及探针的设计是根据已发表的CMV的直接早期蛋白基因的启动子区和开始的4个外显子序列、晚期抗原gp64基因以及磷酸化蛋白pp71基因序列。常用的引物和探针列在表3中。
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(四)PCR扩增步骤
1、10×反应缓冲液:100mmol/L Tris-HCl、pH8.4,500mmol/L KCl,25mmol/L MgCl2,2mg/ml明胶。

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Taq DNA 聚合酶:5U/μl 。

10×dNTP:4种dNTP各2.0mmol/L。

引物:100pmol/L。

2、常规PCR扩增

10×反应混合物(50μl)反应缓冲液 5μl 医学百科网-MedBaike. com

10×dNTP 5μl

模板DNA 5μl

Taq DNA聚合酶 0.2μl (IU)

引物 各0.5μl

蒸馏水 3.8μl
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加1~2滴矿物油。

将反应混合物于94℃加热5min;然后于95℃ 30s,55℃ 40s,72℃ 60s,扩增35~40循环。

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巨细胞病毒感染巨细胞病毒感染
3、套式(nested)PCR扩增:①反应混合物的组成同(2),仅引物为IE2a和IE4b(包括了整个外显子3,共721b),各100pmol。于94℃ 60s,52℃150s,72℃ 480s,扩增20循环。② 取2μl 上述扩增产物,各加100pmol的引物IE3a和IE3b补加其他试剂。然后,于94℃ 60s,52℃150s,72℃180s,扩增20循环。
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(五)产物鉴定
扩增产物的分析可采用固相(滤膜)杂交和液相杂交试验。
1、 固相杂交:
① 预杂交液为3×SSPE,5×Denhardt,0.5%SDS和25%甲酰胺.含有扩增产物的滤膜于42℃预杂交30~60min。 医学百科网-MedBaike. com
② 加入标记探针(10cpm/μg,2ng/ml),杂交30~60min。
③ 用0.2×SSPE,.01%SDS分别于室温洗涤滤膜3次,5min/次;于60℃洗一次,10min/次;再于室温洗一次以上,5min/次。
④ 自显影。

2、 液相杂交及电泳分析: 医学百科网-MedBaike. com
① 取1/10体积的扩增产物与0.5~1.0pmol末端记的探针混合。
② 加入最终浓度为150mmol/L NaCl,10mmol/L磷酸钠及1mmol/L EDTA溶液,使总体积为20μl 。

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③ 95℃ 10min,然后于56℃ 60min。
④ 离心10s加入样品缓冲液,于8%聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。
⑤ 电泳毕,用溴化乙锭染色,然后对X线片曝光,自显影。 医学百科网-MedBaike. com

HCMV DNA分子很大,其碱基序列尚未全部搞清。虽然它的DNA的限制性内切酶片段长度具多形性,但是对其基因组的离散性还不清楚。用单一引物对进行PCR扩增,可鉴定90%的HCMV野型分离株;而采用针对不同HCMV序列的两套以上的引物对,则可检测几乎所有的病毒株。因此,可根据情况使用两对或两对以上的位于基因组不同区域的引物进行PCR检测。 医学百科网-MedBaike. com

在HCMV模板DNA制备过程中,有时会产生一些小片段DNA,在PCR反应时常导致一定水平的本底产物,从而影响对结果的判定。在这种情况下可采用套式PCR法,其基本原理就是靶DNA的扩增分为两步:首先利用一对引物,扩增包括靶DNA在内的长片段DNA;然后取少量的扩增产物,利用只针对靶DNA的引物再进行第二次扩增。通过控制每步中的扩增循环数,即可防止由小片段DNA引起的假阳性。这种方法也可避免产生假阴性结果。 医学百科网-MedBaike. com

巨细胞病毒感染巨细胞病毒感染
PCR检测HCMV标本具有很高的敏感性。从HCMV感染的组织培养上清可检测到相当于几十个病毒的DNA分子或1~5PFU病毒的DNA序列。用非放射性寡核苷酸探针进行Southern杂交分析扩增产物,可从尿液标本中检测到1pgHCMV DNA序列的水平;利用该系统,在4×104个细胞中只有一个病毒基因组即可检测出,较斑点印迹杂交提高2×103倍。 医学百科网-MedBaike. com

PCR技术对HCMV感染的检测具有临床应用价值,因为体液中病毒DNA先于病毒感染的临床症状或血清学证据的出现,可作为HCMV感染的早期指标。由于HCMV可通过胎盘内感染、产道感染等途径传播,而且受感染的新生儿死亡率较高,因此利用PCR进行早期诊断及采取及时的治疗措施,对优生优育也有重要意义。利用这种方法,还可鉴定器官或组织移植手术中供体是否为HCMV与许多严重病症的关系。再者,PCR检测指标稳定,还可进行半定量分析,因此可作为评价各种抗病毒药物疗效的手段。 医学百科网-MedBaike. com

治疗措施编辑本段回目录

巨细胞病毒感染巨细胞病毒感染
巨细胞病毒感染的治疗,可应用各种抗病毒制剂如GCV、抗巨细胞病毒的免疫球蛋白制剂、干扰素及转移因子等。但这些药物并不能解决根本问题,往往停药后病毒又潜伏地回升,鉴于此种病毒可能作为艾滋病的病因之一,各国学者均在致力于控制其感染的研究。最近,美国学者研制出两种活疫苗,初试后颇见效。一种是由AD169菌株研制成的;另一种是从TOWn菌株制成的,经非肠道给药后,已明显表现出有抗巨细胞病毒的效能,CMV抗体升高,导致免疫功能增强。 医学百科网-MedBaike. com

发病机理编辑本段回目录

巨细胞病毒感染巨细胞病毒感染
CMV感染可引起机体的免疫功能降低,特别是细胞免疫功能下降。CMV感染对胸腺发育及脾细胞、单核吞噬细胞、NK细胞CTL细胞功能有着显著的影响。 医学百科网-MedBaike. com

一、对胸腺、脾脏的影响

实验室急性CMV感染的新生豚鼠,胸腺发育受抑,T细胞数减少,成年鼠感染CMV后,88%胸腺可检出CMV。

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CMV感染致脾功能受影响,脾脏淋巴细胞对conA刺激的增殖下降,脾细胞产生的IL-2显著降低。 医学百科网-MedBaike. com

二、对免疫细胞的影响

CMV感染引起的免疫抑制与病毒在细胞内的复制有关。CMV可以在单核吞噬细胞、T细胞、B细胞及一些尚未确定的单核细胞中复制,其中单核吞噬细胞最易感染CMV,淋巴细胞在免疫反应中具有重要的调节功能和效应功能。CMV感染后,可引起淋巴细胞的多种免疫功能受损。
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CMV感染多表现为急性单核细胞增多症。外周血淋巴细胞对有丝分裂原、CMV抗原和HSV抗原增殖反应减弱,诱导干扰素水平下降,CD4/CD8比值从1.7±0.7下降为0.2+0.2,T细胞活性降低.这种变化有的可持续相当长时间,病后10个月,大多数患者T细胞亚群比例仍未完全恢复正常。 医学百科网-MedBaike. com

CMV感染的免疫抑制作用主要是被病毒感染的大单核细胞CD8细胞的功能异常所致。单核吞噬细胞在抗CMV免疫中起着枢纽作用,不但可以直接吞噬、杀伤病毒,更重要的是可以处理、提呈抗原,分泌细胞因子,调控和扩大免疫反应。当CMV感染后,单核吞噬细胞功能受到影响,CMV感染巨噬细胞引起其吞噬功能降低,细胞内氧自由基产生减少,FC受体、补体受体的表达发生改变,且其抗原提呈功能降低,产生IL-1降低,对IL-1及IL-2的反应亦降低。Moses等用胸腺细胞增殖试验检测,IL-1活性降低,IL-1产生降低可引起TH/TS细胞比例失衡。
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巨细胞病毒感染巨细胞病毒感染
NK细胞有拮抗CMV扩散的作用。NK细胞积极参与了抗CMV感染的全过程,但存在高的NK活力不一定是?;ば杂Υ?,而是活动性感染的证明。NK细胞虽不能阻止原发性CMV感染的出现,但一旦存在感染后,NK细胞能在CMV感染早期出现,有限制扩散、使感染局限的作用。NK细胞、CTL细胞CMV的重要效应细胞。在CMV复制早期,感染性病毒体产生前,它们能裂解感染细胞,使病毒在细胞间扩散流产。在小鼠模型中,病毒作用了3-5天时,抗病毒效应由NK细胞介导,NK细胞活性可由IFN增强。6-21天,、外周血存在CTL细胞的杀伤活性。NK细胞、CTL细胞活性的高低决定了机体对CMV感染的敏感性及感染恢复的难易性。但CMV感染时,NK细胞及CTL细胞活性亦受到严重影响。此外,特异性细胞免疫有阻止CMV感染再发作用。有人检测了20个发生CMV感染肾移植受者T细胞应答,发现有14个有CMV细胞毒应答,而6个不出现细胞毒应答者有严重的临床后果。因此,特异性T细胞存在,有阻止CMV感染再发的作用。 医学百科网-MedBaike. com

三、抗体有降低CMV感染的毒力作用

机体受CMV的感染后,可出现多种抗体。乳汁、宫颈分泌物、唾液中尽管有特异性抗体出现,包括中和抗体。但仍能检出CMV,说明抗体并不能阻止病毒扩散。胎儿母体被动获得的抗体不能阻断经宫内、产道乳汁传播的感染。研究证明,致死性CMV攻击前,在小鼠腹腔或静脉注入0.2ml高效价抗CMV球蛋白,可完全?;ざ锩庥谒劳?。1个月后再用CMV等二次攻击,动物仍全部存活,表明抗体有降低CMV的毒力作用。 医学百科网-MedBaike. com

初次感染后,CMV将在宿主细胞中无限期存在成潜伏状态??赡芾奂岸嘀肿橹鞴?,尸检提示、、、唾液、中枢神经系统及肠也可能是病毒潜伏场所。先天性感染的严重程度,与缺乏产生沉淀抗体的能力和T细胞对CMV的应答有关。儿童和成年人感染CMV后,在外周血中出现具有抑制细胞毒表型的活化T淋巴细胞,如果宿主的T细胞功能受损,潜伏的病毒就可能复活并引起多种症候群。组织移植后发生的慢性刺激,为CMV活化,诱发疾病提供了条件。某些针对T细胞的强烈免疫抑制剂如抗胸腺细胞球蛋白,与临床CMV症候群高发率有关。此外,CMV在功能上可作为辅助因子,使潜伏感染的HIV活化。

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传染源编辑本段回目录

巨细胞病毒感染巨细胞病毒感染
传染源是患者和无症状的隐性感染者。他们可长期或间歇地自唾液、精液、尿液、乳液子宫颈分泌物中排出病毒。如果与有巨细胞病毒感染的异性性交,而恰好此人此时处于排毒期,则可能被感染。如果孕妇在性生活时染上病毒,则可引起胎儿感染和围产期感染。据统计,由原发性巨细胞病毒感染的孕妇所造成的新生儿的感染率可高达23%,而围产期感染比宫内感染的百分率更高。有人报道约13%的母亲的初乳和乳汁中有病毒排出。此外,输血也常发生巨细胞病毒感染,感染的发生率与输血的数量呈正比,尤其是当血清阳性的供血者给血清阴性的受血者输血时,其感染的危险性最高。此外,长期接受免疫抑制剂治疗的肾移植者中,有90%在尿中可查到病毒,或抗体明显增高。艾滋病患者比正常人更易遭受病毒感染,或使原潜伏在体内的病毒复活。[1]
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